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miTarget? miRNA 3′ UTR 克隆
miRNA 3′ UTR 克隆
復能基因提供哺乳動物表達載體的人、小鼠、大鼠miRNA 3′ UTR克隆，可用于miRNA靶標驗證、預測靶標的功能確證和miRNA對靶標的調控作用的研究。本公司提供兩套3’UTR報告載體。在pEZX-MT05載體中，我們將3’UTR序列（來源于公開的基因序列數據庫）插入到Gaussia熒光素酶報告基因下游，在哺乳動物細胞中由SV40啟動子驅動轉錄生成Gaussia熒光素酶（Gluc）和3’UTR靶標序列的嵌合mRNA，因此無需裂解細胞實時監(jiān)測Gluc的表達，研究mRNA-miRNA的相互作用。在相同載體（pEZX-MT05）上帶有分泌型堿性磷酸酶（SEAP）報告基因。CMV啟動子驅動轉錄的SEAP作為同質粒內的對照，這種雙報告系統可以對多樣本常規(guī)轉染進行精確比較。pEZX-MT06是Firefly/Renilla雙熒光素酶報告載體。3’UTR序列在Firefly（hLuc）熒光素酶報告基因下游，CMV啟動子驅動轉錄的Renilla（hRLuc）作為同質粒內的對照。通過裂解細胞檢測hLuc和hRLuc的表達。
圖1. miRNA 3′ UTR克隆載體骨架
圖2. 靶標序列（3′ UTR）表達克隆中miRNA的抑制作用
已知LIN28基因是miR-125a的靶標。HEK 293細胞轉染Lin28 miRNA靶標序列表達克隆（左）或者共轉染miR-125a前體miRNA表達克?。ㄓ遥?。轉染24小時后檢測GLuc 和內參SEAP活性。僅轉染Lin28 miRNA靶標序列表達克隆的細胞中Gluc和SEAP活性之比定為1（左），以此確定共轉樣本中的比值。如圖所示，miR-125a抑制了GLuc-LIN28-3′-UTR克隆中Gluc 70%以上的活性。